¿Qué es el Protocolo de transferencia de Western?

October 5

Protocolo de transferencia de Western son los estándares exactos por los cuales se realiza la prueba de inmunoblot. Western blot se utiliza para detectar proteínas en una muestra de tejido. El proceso separa las proteínas nativas mediante la determinación de las longitudes de polipéptidos usando una electroforesis en gel. Las proteínas mismos se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se sondearon por anticuerpos.

La primera parte del protocolo de transferencia de western comienza con la recogida de tejidos. Estas muestras se reunieron ya sea de tejido vivo o de un cultivo celular. El tejido se descompone y varios inhibidores de proteasa tales como fosfatasa o se introducen para evitar que las enzimas de la realización de la digestión. Esta parte del protocolo generalmente se maneja en temperaturas frías para preservar los tejidos.

El proceso de electroforesis en gel es el siguiente paso en el protocolo de transferencia de western. En esta parte, las proteínas se identifican por diversos factores tales como el peso molecular o carga eléctrica. Este proceso se completa más comúnmente usando geles de poliacrilamida con un tampón de sulfato de dodecil de sodio. Básicamente, las proteínas se cargan negativamente y se mueven hacia un electrodo cargado positivamente dentro del gel.

La transferencia de las proteínas es la siguiente parte del proceso global de transferencia de western. Una membrana se coloca en la parte superior del gel, seguido de papel de filtro. Como se administra una corriente eléctrica, las proteínas se extraen en la membrana. Esto se conoce como la parte real "blotting" del análisis. Las membranas son muy frágiles y fácilmente susceptible a daños.

El flujo correcto del protocolo de transferencia de western llama para la etapa conocida como vinculante. Con el fin de evitar la contaminación de las propias proteínas por los anticuerpos que necesitan ser añadido, una especie de blindaje debe aplicarse. El tipo más común de bloqueo utiliza sin grasa leche en polvo y un detergente. Esta se une a los lugares abiertos en la membrana y permite resultados más claros cuando se añade el anticuerpo.

La detección es el siguiente paso, según el protocolo correcto. Las proteínas son introducidos a los anticuerpos que se han relacionado con una enzima específica que dará a los investigadores la información deseada. El anticuerpo se incuba con la membrana durante 30 minutos o más. Después, la membrana se lava y un anticuerpo secundario se introduce que se une a la primera. A menudo, un agente luminiscente se utiliza para ayudar a los científicos con el proceso de identificación.

El material se lava de nuevo para eliminar los elementos no consolidados. Análisis del tamaño de las bandas teñidas revela información sobre la importancia y el alcance de una proteína específica. Esto se completa generalmente un par de veces para asegurarse de análisis adecuado. Las opciones para la detección incluyen radiografías, coloración y los productos químicos.